浅述ALK融合突变及其检测方法（上）
作者：闵ALK融合突变是非小细胞肺癌常见驱动基因突变之一，因其靶向药使用时间长，平均生存期长，也被病友们戏称为“钻石突变”。由于ALK融合突变发生概率仅5%-7%左右，不少病友都很羡慕ALK阳性的幸运儿，也希望同样的运气降落在自己身上，于是如何认识ALK融合突变、如何检测ALK突变以及如何看懂结果就成了需要回答的问题。
有很多病友会奇怪自己的基因检测报告上有ALK突变却被告知不能吃靶向药，或者为什么自己的病理报告上写着ALK（+）还要做基因检测？想回答这些问题，我们需要去了解什么是ALK融合突变，究竟是怎么检测的。
什么是ALK融合突变？
让我们先了解一下主角ALK融合突变到底是怎么回事。ALK基因全称为间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK），总共有29个外显子。
为了方便理解，各位可以将它想象成一辆名为ALK的高铁列车，而29个外显子就是列车的29节车厢，那么“融合突变”就是指ALK的某节车厢断裂并且与其他班次的列车车厢相接变成一个新的列车，最常见的是从ALK号列车的20号车厢处断裂，并与另一辆名为“EML4”的基因重新拼接，如下所示。
已发现的所有ALK基因融合突变都是在ALK基因外显子20处发生断裂，而EML4断裂点有外显子2/6/13/14/15/17/18/20，即上图中与断裂后的ALK基因20号外显子重新连接的不但可以是EML4基因13号外显子，也可以是其他外显子。
上面例子可简称为“E13:A20”，即代表EML4外显子13与ALK外显子20融合，有些基因检测报告的结果也采用这种缩写。不同的融合类型使用靶向药的效果也不同，这是后话在此不过多赘述。
随着研究进步，更多的ALK基因融合伴侣被发现，ALK基因20外显子断裂后不仅可能与EML4基因融合，还可能有与KIF5B基因、KLC1基因、TFG基因、HIP1基因等等融合，此类也成为罕见ALK融合突变。
无论是常见融合类型还是罕见融合类型理论上都可以考虑使用ALK抑制剂，如克唑替尼、阿来替尼等等，但假如未发生断裂，仅在ALK基因自身某位点发生点突变，这种不属于融合突变，不推荐使用靶向药，如下图所示。融合突变与点突变虽然都属于基因突变范畴，但是类型不同、意义不同，好比坐错座位（点突变）、车厢重新拼接（融合突变）都是高铁故障却是完全两回事，因此不能将两种突变类型直接等同。
如何检测ALK融合突变呢？
1.IHC免疫组化法就是平常病理诊断用到的免疫组化技术，简单的说就是检查不同指标时需要使用对应的抗体将细胞染色，根据染色强度评估阴/阳性。目前可选择的ALK抗体有4种包括ALK1、5A4、D5F3 以及 1A4，其中非Ventana D5F3抗体因为特异性略低仅适合用于初筛，且实际临床应用也较少。Ventana D5F3抗体的灵敏度和特异性能够达到95%-100%，专家共识推荐优先使用。
2.荧光原位杂交FISH被认为是融合/重排突变检测的金标准，原理简单来说就是用一个红色标签标记ALK基因其他位置，另外一个绿色标签标记ALK基因20外显子，当两个标签重叠时荧光下观察到黄色信号（红色绿色重叠对外显示黄色）说明未发生ALK基因断裂即没有ALK融合突变，而当两个标签分开时则说明ALK基因发生断裂即可能有ALK融合突变，理论上FISH法可检测所有ALK融合突变类型，如下所示。
3.荧光定量PCR（RT-PCR）是一种快速简便的检测方式，其利用DNA/RNA复制原理，用特异性的上/下游引物将目标片段（比如ALK基因中某一段）特定选中并按照指数倍复制扩增，根据产生的荧光信号判读结果。
仍以E13:A20融合类型为例，因为有文献报道过这个融合类型，所以可设计特定识别这个突变的引物A和B，然后在检测时如果发生该融合，特定的上下游引物A和B会结合在融合后的基因片段两端。好比AB两个警察只负责抓捕叫“E13 : A20”的犯人，一旦发现他出现就会固定一头一尾的逮住他，但对别的犯人（融合类型）就会自由放行。引物成功结合后就执行循环指数倍复制扩增并产生荧光信号，当复制扩增到足以探测到的量即表明存在E13:A20融合突变，如下：
4.二代测序NGS是近年来兴起的一种检测技术，因其通量大、检测类型全面的特点能更好满足临床需要，所以推广迅速并成为现在最常用的肿瘤基因检测技术。二代测序的原理较为复杂，在这不做过多赘述，简单描述即通过二代测序检测可以明确待检测基因全长的情况，而并非其中某一个片段，因此无论是待检测基因是发生点突变、融合/重排等都可以检测。
是不是还有点不太理解？那还是用高铁列车的例子，待检测基因还是以ALK基因为例，二代测序就相当于每个车厢的乘务员开始从头到尾每个座位查票，坐错座位的（点突变）、多了个座位的（插入突变）、车厢接错了的（融合/重排突变）一个都跑不了，只要发生了这些问题都能查出来。
这么多种检测方法该如何选择呢？
虽然这四种检测方法都可以用于检测ALK融合突变，但各自也有优劣，结合2022年v1版NCCN指南对于四种检测方法的总结，仅就ALK基因检测来说，FISH法还是首选金标准方法；IHC法因为简单便宜可用于筛查，并且经FDA许可的抗体（Ventana D5F3）可用于独立检测ALK融合无需FISH验证；NGS法也可以用于ALK融合检测，且可以同时检测其他驱动基因，符合当下临床需求；RT-PCR法也可以使用，但对于一些罕见融合无法检测。
如何看懂病理报告中免疫组化的ALK结果？
很多病友看到病理报告的免疫组化结果上写着“ALK Pos（+），ALK Neg（-），ALK D5F3（+/-）”或者“ALK VENTANA（+/-）”的字样，立马感觉头都大了，怎么这么多ALK又是阴性又是阳性的，那到底自己是不是有ALK融合突变呢？
这里我们要搞清楚这些指标分别代表的含义，“ALK Pos（+），ALK Neg（-）”分别代表的是ALK检测阳性对照品（Pos）和ALK检测阴性对照品（Neg），所谓的对照品就是和待检测的病人样本一起检测并经历整个实验过程，当这两个样品的检测结果正常时，也就是Pos结果为（+），Neg结果为（-）时，代表此次检测过程操作正常没有差错且结果可信，满足这个条件后，如果各位还能能看到“ALK （+）”、“ALK D5F3（+）”或者“ALK VENTANA（+）”字样时，那就要恭喜你可能是ALK阳性了，但非VENTANA D5F3抗体检测结果仍需要基因检测加以验证。
后记
那么回到最初的问题——为什么基因检测报告上有ALK突变却不能吃靶向药，又为什么有些病理报告上提示ALK（+）还需要做基因检测？
第一个基因检测报告的问题很简单，分清楚是ALK点突变还是融合突变，只有融合突变才适合使用ALK-TKI；
第二个病理报告的问题首先分清楚是ALK（+）还是ALK Pos（+），前面我们说过了ALK Pos（+）代表的是阳性对照品检测成功，只是用来作为参照物确保检测过程正常的，并不代表病人样本检测结果；其次即便是ALK（+）也要区分是不是Ventana D5F3抗体，若是标注Ventana或者D5F3的后缀，那么就可以直接指导用药，基本不需要基因检测确认，而若未明确的，那么此类抗体的灵敏度和特异性相对差一些，理论上确实需要其他方法加以验证。
选择验证方法时虽然FISH法是ALK融合检测的金标准，但由于一次实验只能排查有没有ALK融合，不能兼顾其他驱动基因是否有突变，而众所周知非小细胞肺癌的驱动基因有9个，为节约样本并提高效率，目前较为习惯的方法是采用NGS或者RT-PCR方法加以验证，技术角度推荐考虑NGS法。
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