凋亡调节T细胞导致免疫抑制和免疫治疗耐药

Nat Immunol. 2017 Oct 30. doi: 10.1038/ni.3868. [Epub ahead of print]
Oxidative stress controls regulatory T cell apoptosis and suppressor activity and PD-L1-blockade resistance in tumor.
氧化应激控制调节T细胞凋亡和抑制活性及肿瘤PD-L1阻滞耐药
（本文最主要意义在于凋亡Treg细胞最终导致免疫检查点抑制剂耐药）
摘要:
活调节T细胞(Treg细胞)抑制抗肿瘤免疫，但Treg细胞在代谢异常肿瘤微环境中的表现仍不清楚。在此，我们展示肿瘤Treg细胞的凋亡，而凋亡的细胞凋亡细胞则清除自发的和PD-L1阻塞介导的抗肿瘤T细胞免疫。生物化学和功能分析表明，腺苷但非典型的抑制因子PD-L1, CTLA-4, TGF-β, IL-35, 和 IL-10等有助于凋亡Treg细胞介导的免疫抑制。从机制看，凋亡的Treg细胞释放并通过CD39和CD73将大量的ATP转化为腺苷，并通过腺苷和A2A通路调节免疫抑制。Treg细胞凋亡是由于其弱的NRF2相关的抗氧化系统，以及在肿瘤微环境中对游离氧簇的高度脆弱性。因此，这些数据支持一种模型，在这种模型中肿瘤Treg细胞通过氧化应激，通过非有意死亡来维持和放大它们的抑制能力。本研究突出了氧化通路，作为一种控制Treg细胞行为的代谢检查点，并影响治疗癌症检查点的治疗效果。
引言:
已有大量研究指导确定CD4+Foxp3+Treg细胞在各种疾病模型中的开发,转化,稳定和内稳态的调节机制。众所周知的是Treg被招募进肿瘤微环境，并起着一个主要的免疫抑制因子，抑制自发的肿瘤相关抗原特异性T细胞免疫力，以及免疫治疗诱导的和活化疫苗诱导的抗瘤免疫力。不过，Treg在代谢异常的肿瘤微环境的作用仍然未知。
瓦尔堡效应在许多癌症是一个重要代谢特征。最近研究表明糖酵解调节T细胞激活和效应子功能。假定营养成分中的葡萄糖在肿瘤吸收很差，可以估计T细胞糖代谢被改变是由于肿瘤微环境瓦尔堡效应的结果。为支持此说法，弱糖酵解可能改变记忆T细胞功能在肿瘤微环境。此外，氧感知脯氨酰羟化酶蛋白，钾离子从坏死细胞释放出来，以及异常锌代谢能损伤肿瘤微环境效应T细胞功能。这些发现强调肿瘤中记忆T细胞代谢调节的意义。
在老鼠模型Treg细胞和T辅助细胞之间内稳态平衡可能通过代谢调节。不过，Treg细胞在人类肿瘤微环境采用记忆和效应子细胞表型。是否肿瘤中Treg细胞受制于糖酵解调节还未知。而且，氧化应激是另一个代谢特征在肿瘤微环境。最近，研究显示髓系树突状细胞（DCs）在肿瘤微环境应氧化应激表型和功能发生改变。不过，还不知道是否氧化应激改变肿瘤中Treg细胞的表型和功能。
为解决这些问题，我们研究人类宫颈癌和几个类型的老鼠癌症肿瘤微环境Treg表型和功能属性，并调查构建Treg细胞的生物学行为的机制和代谢作用。我们观察到肿瘤微环境Treg细胞的高凋亡，凋亡Treg细胞获得超抑制功能通过一个氧化应激相关机制。而且，我们发现氧化应激，而不是糖酵解是其代谢机制，此机制控制肿瘤Treg细胞功能性行为和降低免疫检查点治疗的治疗效果。
结果：
肿瘤微环境中高Treg细胞凋亡
之前研究显示Treg细胞被招募进肿瘤微环境，和抑制肿瘤相关抗原特异性T细胞的免疫力。不过，还不知道Treg细胞异常治疗微环境代谢行为。为调查此问题，我们采用多色流式细胞术分析人类宫颈癌组织原初Foxp3+ Treg细胞和常规Foxp3-CD4 + Treg细胞的增殖和凋亡。我们发现Treg细胞表达更高水平的细胞周期蛋白Ki67在人类宫颈癌肿瘤微环境与常规的Treg细胞相比。此外，流式细胞术分析显示，Treg细胞经历大量凋亡与Foxp3-常规T细胞相比在原发和转移的人宫颈癌组织，这由caspase-3裂解表达确定。我们量化促凋亡和抗凋亡基因数据在人宫颈癌渗透Treg细胞和常规T细胞。Treg细胞表达高水平促凋亡基因记录和低水平抗凋亡基因记录相比于常规T细胞在同样人宫颈癌。我们获得同样类似结果在老鼠模型宫颈癌，结肠癌，黑色素瘤。而且使用基因组富集分析，我们发现在老鼠黑色素瘤渗透Treg细胞富集促凋亡基因。在老鼠结直肠癌培养的Treg细胞，检测到增加促凋亡基因表达和降低抗凋亡基因表达。因此，这些数据表明在肿瘤微环境中Treg细胞高凋亡。
凋亡Treg细胞介导超免疫抑制
Foxp3控制Treg细胞发展和功能完整性。活Treg细胞抑制肿瘤相关抗原特异性T细胞激活。还不知道是否凋亡Treg细胞是抑制功能？为此，我们剥离渗透Treg细胞从人宫颈癌样本，用抗FAS单抗(mAb)诱导其凋亡，并检查其抑制活性。凋亡Treg细胞抑制干扰素γ和肿瘤坏死因子在CD4+和CD8+ T细胞的表达。我们比较活的和凋亡的渗透Treg细胞和凋亡的常规T细胞在人宫颈癌，发现凋亡的Treg细胞更有效抑制IL-2产生相比活的Treg细胞。因此，人癌症相关凋亡的Treg细胞是潜在免疫抑制因子。
接下来，我们进行类似Treg细胞实验在健康和荷瘤老鼠。如期望，在体外T细胞抑制实验中，来自健康老鼠的活Treg细胞抑制T细胞细胞因子产生。我们诱导Treg细胞凋亡使用放射，血清饥饿，氟尿嘧啶和抗Fas单抗，类似于我们观察的人凋亡Treg细胞，与Treg细胞如何被诱导凋亡无关。老鼠凋亡Treg细胞超抑制T细胞TNF和IL-2表达相比于同样数量的老鼠货Treg细胞。我们进一步比较了老鼠黑色素瘤肿瘤渗透的活和凋亡Treg细胞的抑制活性，同样，凋亡老鼠肿瘤渗透细胞比活Treg细胞更具抑制能力。而且，老鼠凋亡的肿瘤渗透Treg细胞，不是肿瘤渗透常规T细胞，强烈抑制T细胞IL-2产生。因此，老鼠肿瘤相关凋亡Treg细胞是强力免疫抑制因子。
除了体外的抑制活性，我们研究是否凋亡的Treg细胞在体内具有抑制免疫活性，使用3个系统： (i) 自发的肿瘤免疫力, (ii) PD-L1阻滞治疗诱导的肿瘤免疫力, (ili) 过继肿瘤相关抗原特异性T细胞注射介导的肿瘤免疫力。在第一个模型，我们处理黑色素瘤老鼠用凋亡的Treg细胞。接受凋亡Treg细胞的老鼠肿瘤体积更大相比于参照老鼠。在此模型，我们研究凋亡Treg细胞对PD-L1阻滞治疗潜在影响。PD-L1治疗降低治疗生长和增强T细胞效应子表达在肿瘤染色的淋巴结和肿瘤组织。不过，凋亡Treg细胞消除这些抗瘤效应子介导的抗PD-L1。因此，凋亡Treg细胞抑制自发和检查点抑制剂诱导的抗瘤免疫力。
最后，我们研究凋亡Treg细胞在2个过继肿瘤相关抗原特异性T细胞转换模型。我们注射1类MHC 限制（卵清蛋白）的T细胞受体转基因T细胞进入荷瘤老鼠，然后肿瘤老鼠使用凋亡Treg细胞和活Treg细胞。 凋亡Treg细胞和活Treg细胞都促进肿瘤生长和抑制效应子T细胞表达。不过凋亡Treg细胞显示超抑制活性相比于活Treg细胞。
凋亡Treg细胞成为超抑制非蛋白因子
接下来，我们研究凋亡Treg细胞抑制T细胞活化的细胞和分子机制。髓系细胞如巨噬细胞，能处理凋亡细胞及可能介导免疫抑制在肿瘤微环境。为研究凋亡Treg细胞介导的免疫抑制是否依赖于巨噬细胞？我们检测凋亡Treg细胞对肿瘤免疫的影响在巨噬细胞删除的黑色素瘤老鼠模型。正如预期，增加凋亡Treg细胞促进肿瘤生长，而巨噬细胞删除抑制肿瘤生长。因此，多功能效应子T细胞细胞因子表达被抑制在添加凋亡Treg细胞情况下和增强表达在巨噬细胞删除情况下。凋亡Treg细胞在巨噬细胞删除后仍有免疫抑制活性。这些观察表明巨噬细胞对凋亡Treg细胞的免疫抑制可有可无。
在分子水平，活Treg细胞表达Foxp3蛋白和介导免疫抑制通过多个活动模式。免疫印迹法显示高水平的免疫抑制效果蛋白，包括PD-Ll, PD-l, CTLA-4, CD39,和 CD73在凋亡Treg细胞相比于同数量的常规T细胞, 与Treg细胞凋亡或存活无关。PD-1和PD-L1阻滞特异性抗体对凋亡Treg细胞免疫抑制属性没有影响。来自PD-L1缺陷和PD-1缺陷和野生老鼠的凋亡Treg细胞抑制T细胞IL-2表达程度相同。CTLA-4阻滞治疗也不能改变凋亡Treg细胞的免疫抑制活性。除了膜蛋白外，有可能类似于活Treg细胞，凋亡Treg细胞可能释放可溶因子包括介导T细胞抑制的细胞因子。凋亡Treg细胞释放未知可溶免疫抑制因子，而TGF~β，lL-35和lL-10并未涉及凋亡Treg细胞的免疫抑制。
为确定可溶的免疫抑制因子，凋亡Treg细胞培育在葡萄聚糖处理的碳里，导致免疫抑制属性丢失。表明可溶免疫抑制因子是小分子，不是蛋白或大型肽。
凋亡Treg细胞介导抑制经由A2A通路
活老鼠Treg细胞表达CD39和CD73，转换ATP为腺苷酸，活人癌症渗透Treg细胞表达CD39和CD73并抑制效应子T细胞通过一个腺苷通路。我们注意到凋亡Treg细胞表达CD39和CD73释放一个非蛋白免疫抑制小分子。因此，我们假定凋亡Treg细胞的CD39和CD73具有酶活性并介导腺苷酸生产，而非蛋白免疫抑制小分子可能就是腺苷酸。凋亡Treg细胞培养6小时后腺苷酸大量出现并达到峰值。添加外源性腺苷酸到老鼠T细胞培养，降低了TNF和IL-2产生。A2A是T细胞腺苷酸受体，尤其介导IL-2抑制。A2A抑制剂ZM241385消除凋亡Treg细胞介导的T细胞效应子的免疫抑制。我们扩展老鼠研究到人宫颈癌，再一次，宫颈癌渗透的凋亡Treg细胞抑制T细胞激活。ZM241385消除了其免疫抑制。因此，凋亡Treg细胞介导的免疫抑制通过腺苷酸及A2A通路。
凋亡Treg细胞释放ATP并代谢为腺苷酸
接下来， 我们探究凋亡Treg细胞如何生产大量腺苷酸在缺乏外源性ATP情况下.基因组富集分析表明老鼠黑色素瘤渗透凋亡Treg细胞显示基因相关嘌呤和嘧啶碱代谢的激活表达，意味高能量代谢。我们假设并验证凋亡Treg细胞生成，释放，随后转变ATP为腺苷酸通过凋亡细胞相关的CD39和CD73，最终抑制T细胞活化通过肿瘤腺苷酸。凋亡Treg细胞释放大量ATP，也释放小分子经由pannexin-1依赖通路，pannexin-1抑制剂（丙磺舒或甘珀酸）阻止凋亡Treg细胞释放ATP。腺苷酸的数量肯定与ATP的数量相关。
为确定凋亡Treg细胞CD39和CD73是否具有功能性，我们治疗凋亡Treg细胞使用CD39抑制剂ARL671 56和CD73抑制剂AMP-CP。如同预期， ARL67156, 非AMP-CP,阻止ATP 降解。而且， CD39和CD73抑制剂挽救被凋亡Treg细胞抑制的 IL-2表达。我们检测ARL67156和dZM241385影响凋亡Treg细胞介导的免疫抑制在有无PD-L1治疗情况下，肿瘤体积变化显示此2抑制剂部分消除凋亡Treg细胞的免疫抑制，改善PD-L1治疗效果。总之，凋亡Treg细胞释放高水平ATP 并代谢为腺苷酸经由CD39和CD73，并抑制T细胞通过腺苷和A2A交互。
氧化应激诱导肿瘤Treg细胞凋亡
宫颈癌腹水和过氧化合物治疗导致抗凋亡基因高表达，促凋亡基因低表达。在宫颈癌腹水检测到高浓度的主要ROS成分超氧化物。宫颈癌渗透的Treg细胞显示高线粒体活性和生成瘤内更多ROS。肿瘤微环境Treg细胞更敏感于氧化应激。细胞抗氧化系统很大程度受转录因子NRF2（nfe2/2）和相关基因调节。治疗黑色素瘤老鼠使用萝卜硫素降低Treg细胞凋亡，增加效应子T细胞细胞因子的表达，并抑制肿瘤生长。氧化应激诱导Treg细胞凋亡通过ROS在肿瘤微环境中，反而增强其免疫抑制活性。
探讨：
Treg细胞被招募进肿瘤微环境。人们认为一定是活的Treg细胞而不是凋亡Treg细胞介导免疫抑制。令我们吃惊的是，凋亡Treg细胞具有更高的抑制T细胞激活在体内和体外。更重要的是，Treg细胞消除了老鼠模型的PD-L1治疗效果。大量患者对PD-L1/PD1治疗没有应答或耐药，使得我们思考临床低疗效是否与高水平的凋亡Treg细胞有关。但删除Treg细胞的实验没有在人类癌症起作用，可能是治疗诱导Treg细胞凋亡，维持和扩大凋亡Treg细胞免疫抑制。
PD-L1, CTLA-4, TGFβ， IL-I0，和IL-35是良好定义的活Treg细胞免疫抑制成分。我们研究说明这些分子没有涉及凋亡Treg细胞的免疫抑制活动。活Treg细胞表达CD39 和CD73转换胞外ATP 为腺苷酸，依次介导免疫抑制经由腺苷酸和A2A 受体信号通路。我们观察到凋亡Treg细胞释放大量ATP，并有效转变ATP为免疫抑制腺苷酸经由 CD39 和 CD73在体外和体内。因此，可以推测凋亡Treg细胞 CD39 和CD73保留酶活性 。而且，凋亡Treg细胞释放大量ATP进入胞外空间经由萝卜硫素通道。老鼠模型与此一致。因此，凋亡Treg细胞能自己供给和释放ATP, 并转变为腺苷酸在局部环境。我们提出一个新的免疫逃逸机制：肿瘤渗透Treg细胞非故意凋亡介导，支持和扩大肿瘤微环境的强大免疫抑制。
已报道Foxp3Treg细胞一个促凋亡因子在老鼠模型。除非一些生存因子如γ链细胞因子存在。几个代谢检查点分子，包括AMPK, mTORC1和H1F-1α, 可能生理上调节Treg细胞功能和Treg细胞和T细胞之间平衡在老鼠模型。不过，Treg细胞如何在代谢异常的肿瘤微环境行为还不清楚。糖酵解深刻改变了效应子T细胞的表型和功能在肿瘤微环境。我们观察到Treg细胞不像效应子T细胞 那样对糖酵解限制敏感。相反Treg细胞对氧化应激脆弱在肿瘤微环境。我们数据显示自由氧簇针对线粒体和诱导Treg细胞凋亡，随后触发Treg细胞抑制性的级联效应在肿瘤微环境。因此，我们的研究补充最近报道的记忆T细胞和DC的代谢控制，并扩展到Treg细胞在人类和老鼠的肿瘤微环境。
总之，凋亡Treg细胞介导免疫抑制可能是癌症Treg细胞主要的行为模式，并是检查点阻滞治疗耐药的一个潜在机制。而且，Treg细胞凋亡由氧化应激触发是一个新的肿瘤免疫逃逸机制在肿瘤微环境。靶向肿瘤代谢是一个可行的癌症治疗策略。
（因没有文字全文，只能找照片逐行翻译，省略不少。）

学习了，谢谢大牛分享！

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哦也。楼主还在研究。说明状况不错。祝福