第三代ERBB激酶抑制剂来那替尼

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Oncotarget October 09, 2017
HDAC inhibitors enhance neratinib activity and when combined enhance the actions of an anti-PD-1 immunomodulatory antibody in vivo
HDAC抑制剂增强来那替尼活性且联合在体内增强抗PD-1免疫调节抗体的活性
（HDAC抑制剂和来那替尼都已上市，HDAC组蛋白去/脱乙酰化；来那替尼是第三代ERBB抑制剂）
摘要： NSCLC患者的肿瘤对阿非替尼耐药，目前几乎没有有效的治疗选择来延长他们的生存。阿法替尼耐药的NSCLC细胞对不可逆的泛HER抑制剂来那替尼的临床相关浓度很敏感，但不是对第一代的ERBB 1/2/4抑制剂拉帕替尼。在多个阿法替尼耐药的肿瘤克隆中，HDAC抑制剂降低了ERBB1/3的表达，但是激活的c-SRC，导致了更高的ERBB 1/3磷酸化。来那替尼还迅速降低ERBB1/2/3/4、c-MET和突变的K-/N-ras基因的表达; K-RAS与磷酸化的ATG13一起定位，并与组织蛋白酶B一起定位在囊泡中。将细胞暴露在来那替尼+HDAC抑制剂中，导致mTORC1和mTORC2的灭活，增强自噬物和随后的自溶酶体的形成，并导致了更大增加对细胞死亡的诱导。敲除贝林1或ATG5阻止HDAC抑制剂或来那替尼降低ERBB 1/3/4和K/N-ras表达，减少来那替尼+HDAC抑制剂的杀伤力。来那替尼和HDAC抑制剂通过自噬减少了多种HDAC蛋白的表达，从而导致PD-L1, PD-L2表达和鸟氨酸脱羧酶的表达的减少，并且增加了I类MHCA（主要组织相容性复合体）的表达。在体内，来那替尼和HDAC抑制剂相互作用抑制了4T1乳腺肿瘤的生长，此效果被抗PD-1抗体增强。我们的数据支持了使用HDAC抑制剂可以增强来那替尼的致死率的假设，在阿法替尼耐药的NSCLC中，来那替尼可能是一种有用的治疗工具，而尼拉替尼+HDAC抑制剂的暴露可以促进抗肿瘤的免疫应答。
引言：
表皮生长因子受体的过度表达(EGFR，ERBB1)多年来一直被认为是肿瘤细胞生长，入侵和化疗耐药的生物标志物。该受体家族的其他成员，ERBB2，ERBB3和ERBB4，也与致癌性耐药表型有关。由于ERBB1在许多肿瘤中被过度表达，上世纪90年代的几家制药公司研发出了抑制ERBB1的药物，如吉非替尼、埃罗替尼。在临床上，与实验室不同的是，过度表达ERBB1的肿瘤对ERBB1抑制药物的敏感性并不高。在某种程度上，这是因为吉非替尼和埃罗替尼都未能抑制ERBB2，而且这些药物的使用也可以促进补偿细胞的生存—通过ERBB2：ERBB3复合体的形成，已经保护细胞PI3K下游通路的激活。吉非替尼/埃洛替尼失败的其他机制包括其他细胞保护生长因子受体激活，如c-MET。
早期对ERBB1抑制剂的研究最终导致了两个新的研究方向。一个途径是合成新的抑制剂，可以阻断ERBB1、ERBB2和ERBB4的信号。第二种方法是理解为什么一些肿瘤细胞在埃罗替尼或吉非替尼暴露后会出现快速死亡反应，而其他的肿瘤细胞，表达相同的ERBB1蛋白质，对药物相对不敏感。第一个被临床批准的ERBB1/2/4抑制剂是拉帕替尼，并被批准用于联合卡倍他滨治疗乳腺癌。除了已知在胶质母细胞瘤患者中发现截断的ERBB1突变体外，研究人员随后还发现了全长ERBB1的突变氨基酸，导致突变酶有显著更高的特异活性。突变的全长ERBB1在10-15%的NSCLC患者中发现，一般在那些以前没有吸烟的患者身上。在胶质母细胞瘤、乳腺、前列腺癌和头颈癌患者中也发现了完整的突变激活ERBB1。随着在NSCLC中的突变活性ERBB1的临床经验的发展，人们注意到，在治疗开始6-18个月后，成功地接受了erlotinib/gefitinib单疗法的患者将会出现耐药性。
耐药性机制的一个主要组成部分是由于ERBB1催化部位的第二次突变的进化，阻止了埃罗替尼/吉非替尼阻止的ATP水解。发现其他的临床耐药机制包括上调其他补充生存信号受体，例如c-MET。
本研究以确定不可逆的泛HER抑制剂来那替尼是否可以单独使用，或与其他药物联合使用，以杀死具有阿法替尼耐药的H1975细胞的多个克隆体。然后，我们需要确定，在体内来那替尼依赖免疫调节蛋白的调节是否能增强检查点抑制抗体活性的作用。我们的数据表明，来那替尼，而不是拉帕替尼，杀死了阿法替尼耐药的H1975的克隆体，而且组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂增强了来那替尼的致死率。另外，来那替尼+HDAC抑制剂促进了检查点抑制剂的抗肿瘤免疫应答。
结果：
来那替尼是第三代口服ERBB1/2/4抑制剂，不可逆转地与ERBB1、ERBB2和ERBB4结合。来那替尼已经被证明对乳腺癌ERBB2扩增或突变有临床活性。在多种肿瘤细胞类型中，来那替尼显著增强了丙戊酸的致死性，包括突变B-RAF黑素瘤，胶质母细胞瘤和卵巢癌，在结肠癌和胰腺癌中，以及在阿法替尼耐药H1975克隆;值得注意的是,虽然来那替尼和阿法替尼作为单药都能杀死5/5个亲代野生型H1975克隆, 它们都是单药,当联合丙戊酸时，但只有来那替尼能杀死5/5个阿法替尼耐药的H1975克隆。第二代ERBB1/2/4抑制剂拉帕替尼不影响肿瘤细胞阿法替尼耐药克隆的活性。E3配体NEDD4调节脂质磷酸酶PTEN的表达。敲除NEDD4增强PTEN的表达和增强来那替尼杀死阿法替尼耐药H1975克隆。总的来说,我们的研究结果认为来那替尼可以取消HDAC抑制剂激活c-SRC / ERBB1 / ERBB3 / AKT生存信号,从而增强HDAC抑制剂杀死癌细胞,并且作为单药，来那替尼可以克服阿法替尼耐药的5/5个H1975克隆。
ERBB家族受体既能同源二聚化又能异源二聚化。在阿法替尼耐药克隆中， ERBB1能够同源二聚化自己和异源二聚化ERBB2, ERBB3和ERBB4. ERBB4 能够同源二聚化自己和异源二聚化ERBB1, ERBB2和 ERBB3. ERBB3不能同源二聚化。在父系 H1975克隆, ERBB1和ERBB3 并不强烈出现一起定位。在阿法替尼耐药的克隆，显示ERBB1和 ERBB3一起定位。与ERBB1 和ERBB3对比, ERBB1和ERBB4存在一起定位既在父系也在阿法替尼耐药的克隆。c-SRC和ERBB1一起定位在父系和阿法替尼耐药克隆里非常相似。在阿法替尼耐药的克隆，苏打丙戊酸激活c-SRC, 这与增加PI3K p110α/β和ERBB3 一起定位有关。丙戊酸增加ERBB1和ERBB3一起定位, 但不是ERBB1 和ERBB4一起定位。
接着确定来那替尼杀死阿法替尼耐药H1975细胞的机制。来那替尼灭活mTORC1 (S2448) 和mTORC2 (S2481) 在5/5个克隆。丙戊酸只能适度减少mTORC1 和mTORC2 活性。使用来那替尼 + 丙戊酸治疗增加了自噬体数量，随后自溶体数量也增加在治疗细胞里。激活mTOR 的表达阻止自噬体形成和降低来那替尼 + 丙戊酸杀伤力。mTOR和诱导的自噬流量对+ 丙戊酸的联合治疗起重要作用。
与来那替尼不同的是，阿法替尼和拉帕替尼单一的药物都不能引起肿瘤细胞内的大细胞内液泡的出现。然而，这三种药物都通过抑制ERBB1/2/4而对细胞产生作用。我们推测，除了抑制ERBB1/2/4的效力/浓度之外，来那替尼、阿非替尼和拉帕替尼之间的分子作用的唯一主要区别是，来那替尼的化学修饰作用是其抑制作用的部分原因，等等，来那替尼是一种不可逆转的抑制剂。因此，我们比较了来那替尼和阿法替尼对ERBB1、ERBB3、ERBB4的全部蛋白表达的影响，以及在阿法替尼耐药克隆中的参照c-MET。在一种依赖时间的方式中，来那替尼，而非阿法替尼，减少了ERBB1、ERBB3和ERBB4的总表达。在细胞中，没有表达突变的活跃的ERBB家族受体，来那替尼，而不是阿法替尼，迅速减少了ERBB1和ERBB2的表达。
受体c-MET的研究最初是作为一种负参照，也就是说，来那替尼不抑制或改变c-MET。然而，令我们吃惊的是，我们发现了来那替尼，但不是阿法替尼，下调c-MET表达。敲除自噬调节蛋白Beclin1或者ATG5，或者用E3连接酶抑制剂硼替佐米(万珂)进行治疗，阻止了ERBB1的下调。相比之下，对Beclin1或ATG5的敲除阻止了c-met的下调，但是用蛋白酶抑制剂治疗的细胞却没有。丙戊酸还能减少ERBB1和ERBB3的总表达，而通过降低Beclin1阻止这种效果。因此，来那替尼既抑制又下调了ERBB家族受体酪氨酸激酶的表达，也抑制了其他的RTK。
就如我们观察到的是，ERBB家族受体和c-MET的减少，我们推断其他膜相关的信号蛋白也可能会降低它们的表达水平。原癌基因K-RAS在肺癌、胰腺癌和结肠癌中经常发生突变。突变K-RAS肿瘤细胞耐药表型-突变的K-RAS基因发信号到ERK1/2、ERK5、JNK和PI3K信号通路上，在转化、促进生长和凋亡扮演着关键的作用。来那替尼治疗，除了减少受体酪氨酸激酶的表达外，还减少了多种肿瘤细胞类型中突变激活K-RAS基因的表达。来那替尼和丙戊酸相互作用，进一步降低K-RAS的表达，这与增加的ATG13 S318磷酸化有关。敲除自噬调节蛋白ATG5或Beclin1可阻止来那替尼减少K-RAS的表达。在卵巢癌细胞系中，表达一种突变的N-RAS基因，来那替尼，以及更大范围内的来那替尼+丙戊酸，在自噬依赖的方式中减少了N-RAS的表达。我们的数据表明，在治疗表达突变的K-RAS基因或突变的N-RAS基因的肿瘤中，来那替尼可能有疗效。
我们最近发表的一篇文章说，组蛋白脱乙酰酶蛋白可以通过自噬消化来下调。因此，我们假设，除了减少受体和K-RAS的表达外，使用来那替尼治疗阿法替尼耐药H1975克隆会减少多个HDAC蛋白的表达;这个假设是正确的，我们观察到来那替尼降低了HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC6和HDAC10的水平。来那替尼治疗TNBC（三阴乳腺癌）和ERBB2+乳腺癌细胞也减少了p62 SQMT1、LAMP2、HDAC6、drp-1、线粒体HSP70、HSP70、HSP90和GRP78的表达。来那替尼正在增强自噬通量，并产生内质网压力反应。
在过去的5年里，来自同个实验室的多项研究表明，ERBB1/2/4 (拉帕替尼，阿法替尼)抑制剂可以提高细胞毒性药物和其他激酶抑制剂的杀伤力。在体外和体内，来那替尼提高了培美曲塞和索拉非尼，regorafenib + sildenafil，达沙替尼，ruxolitinib的杀伤力。使用检查点抑制抗体对NSCLC治疗带来革命性变化。众所周知，那些表达突变ERBB1肿瘤对ERBB抑制剂耐药的患者，对检查点抑制抗体的反应比其他基因NSCLC变种的患者要差。与这些发现相一致的是，阿法替尼耐药H1975克隆体表达了较低水平的PD-L1, PD-L2,、MHCA和HMGB1，以及鸟氨酸脱羧酶(ODC)与父系克隆相比。采用丙戊酸治疗基因多样性的NSCLC细胞系降低了PD-L1, PD-L2和ODC的表达，并增加了MHCA和HMGB1的表达。在阿法替尼耐药的H1975克隆中，丙戊酸也减少了PD-L1, PD-L2和ODC的水平，并增加了MHCA的表达。基于这一数据，说明阿法替尼耐药克隆过度表达HDAC3和HDAC10的事实，我们确定了两者是否或两者都控制了免疫生物标记的表达。在克隆依赖方式敲除HDAC3，减少了PD-L1和PD-L2的表达，增强了MHCA的水平。HDAC10敲除降低了 PD-L1和ODC的表达式，增强了MHCA的水平。一起敲除HDAC3和HDAC10进一步降低了ODC表达。
然后我们研究了来那替尼+丙戊酸的药物联合是否会进一步影响阿法替尼耐药性H1975克隆的免疫原性。为此，我们测量了来那替尼对PD-L1, PD-L2,MHCA、ODC和HMGB1的表达的影响。在阿法替尼耐药H1975的克隆中，作为单一药物，来那替尼减少了PD-L1, PD-L2和ODC的表达，并增加了MHCA的水平。来那替尼也引起了HMGB1（高迁移率族蛋白）的细胞外释放。在自发的小鼠结直肠、乳腺、肺和乳腺肿瘤分离物，来那替尼和丙戊酸酯单独或联合，减少了PD-L1, PD-L2和ODC的表达，并增强了MHCA的表达。类似的发现也出现在人类乳房BT549细胞。在肿瘤细胞暴露于培美曲塞+索拉非尼，regorafenib + sildenafil，ruxolitinib +来那替尼，来那替尼+达沙替尼后，减少PD-L1, PD-L2和ODC的表达，MHCA水平增强。总之，来那替尼 +丙戊酸治疗通过增加肿瘤细胞表面I类MHC的水平有可能提高T细胞介导的对肿瘤细胞杀死,和通过减少PD-L1等抑制性配体的表达。